宝泉岭管局新华农场某队和二九一农场某队饲养的肉牛和奶牛，临床表现突然发病，食欲减退，反刍停止；死亡牛剖检可见心脏表面刷状出血，肝脏肿大，前胃黏膜易脱落，有点状和片状出血。真胃黏膜水肿、脱落或有弥漫性出血，脾肿胀不明显，被膜下或边缘部有出血点，肠管外观呈暗红色，内容物呈西红柿酱样，肠黏膜严重出血。根据流行病学调查和实验室诊断，鉴定为由A型产气荚膜梭菌引起的肠毒血症。报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料 绵羊血琼脂平板、肉肝胃膜消化汤均由微生物实验室自制；小鼠购于牡丹江医学院实验动物中心；PCR反应所用试剂购于长春克隆生物试剂有限公司；引物由上海生工生物技术服务公司合成。
1.2 菌株 实验菌株2911、2913、XH从送检病料中分离；标准菌株64701（A型）购于中国兽医药品监察所微生物室。
1.3 引物 参考Saito和Fach 等所报道的引物序列，根据已经发表的文献资料，设计了5对引物，引物序列如下：
cpa： 5′-GCT AAT GTT ACT GCC GTT GA-3′
5′-CCT CTG ATA CAT CGT GTA AG-3′
cpb： 5′-GCG AAT ATG CTG AAT CAT CTA-3′
5′-GCA GGA ACA TTT AGT ATA TCT TC-3′
etx： 5′-GCG GTG ATA TCC ATC TAT TC-3′
5′-CCA CTT ACT TGT CCT ACT AAC-3′
iA： 5′-ACT ACT CTC AGA CAA GAC AG-3′
5'-CTT TCC TTC TAT TAC TAT ACG-3'
cpe： 5′-GGA GAT GGT TGG ATA TTA GG-3′
5′GGA CCA GCA GTT GTA GAT A-3′
1.4 病原菌分离培养 无菌采取小肠内容物用生理盐水稀释2～4倍，500 r/min离心10 min，取上清，由于肠道中的常在菌较多，不宜分离纯化，因此分离前要预先处理，将肠内容物稀释液置80℃水浴锅内恒温30 min，然后取处理液50 μl用“L”玻璃棒涂于绵羊血琼脂平板上，37℃厌氧培养72～96 h，挑取呈现明显α、β双溶血环的单个菌落涂片、染色、镜检，进行细菌的纯培养。将纯培养物接种于肉肝胃膜消化汤中增菌。
1.5 动物感染试验 取每株纯化后的分离菌液体培养物的上清液，通过腹腔注射1 ml和尾静脉注射0.2 ml各接种2只小鼠，同时设对照组。观察小鼠死亡情况。
1.6 产气荚膜梭菌的PCR检测 (1)将纯化的待检菌和阳性菌分别接入肉肝胃膜消化汤中，37℃培养18 h，取1 ml培养液于小离心管中8 000 r/min离心10～15 min，弃去上清液，用无离子水1 ml悬浮菌体，然后加热煮沸15 min，再12 000 r/min离心5 min，取上清液作为P
CR反应模板。(2)PCR反应总体积为25 μl，即10×PCR缓冲液2.5 μl ，25 pmol/ml的上、下游引物各1 μl，2.5 mmol/ml的dNTP 1 μl， 5 u/μl 的Taq DNA聚合酶0.2 μl，样品DNA模板1 μl，加水补足25 μl。(3)94℃变性10 min，然后94℃变性1 min，55℃ 1 m
in，72℃ 1 min，共循环35次，最后在72℃延伸10 min。(4)PCR反应结束后取5 μl产物在1.0%琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下观察并拍照，分析PCR扩增结果。
1.7 PCR检测的特异性试验 分别以大肠杆菌，停乳链球菌，葡萄球菌，空肠弯曲菌等作阴性对照，检测PCR的特异性。
1.8 PCR检测的灵敏性试验 将291-3接种肉肝胃膜消化汤培养基培养18 h，用血球计数器计数后，调整菌液浓度为105 CFU/ml，取1 ml菌液于离心管，提菌体DNA，倍比稀释后将其作为模板进行PCR扩增，检测其最小检出量。
2 结果
2.1 病原菌分离培养 在显微镜下均为革兰氏阳性大杆菌，多数单在，菌体较粗。固体培养基上菌落多数为圆形、表面光滑、微隆起、半透明；血液培养基上多数菌落有双溶血环，少数不溶血。
2.2 动物感染试验 尾静脉注射291-1、291-3、XH菌上清液后10 min内全部死亡。尾静脉注射生理盐水的对照组72 h内未见死亡。腹腔注射291-1、291-3、XH菌液组，4 h内全部死亡。腹腔注射生理盐水对照组72 h内未见死亡。
2.3 PCR扩增 利用合成的5种引物分别进行PCR扩增，只有A 型引物扩增出一大小为324 bp的目的片段，结果如图1。
2.4 特异性试验 分别以大肠杆菌、链球菌、空肠弯曲菌、葡萄球菌为阴性对照，进行特异性试验。结果见图2。
2.5 敏感性试验 将培养液经细菌计数,制备DNA模板进行10倍倍比稀释，分别取各个稀释度的稀释液1 μl做模板进行PCR扩增，经电泳结果分析，最小检出量可达103 cfu/ml，详细结果见图3。
3 小结与讨论
3.1 经实验室综合诊断，可以确诊引起牛死亡的病原体均是A型产气荚膜梭菌。
3.2 产气荚膜梭菌是一种非常重要的人畜共患病原微生物，在自然界分布很广，常见于土壤、水源、饲料、圈舍、肠道内，在饲养环境和饲料突然改变等诱因下，就可以引起动物突然发病死亡，如牛、羊肠毒血症、坏死性肠炎、猝击症等，给养殖业带来巨大经济损失。
3.3 长期以来主要采用传统的实验室方法和动物毒素中和试验来鉴别产气荚膜梭菌的血清型，操作起来比较繁琐，而且有诸多不定的影响因素，容易造成试验误差。为提高产气荚膜梭菌的鉴定与分型准确率，缩短诊断时间，近年来许多学者开始考虑用分子生物学方法直接检测产气荚膜梭菌的肠毒素基因，克服常规方法的局限性。本试验采用的PCR方法则可对直接检测毒素的基因，从而不依赖于该菌是否产生了肠毒素。结果表明PCR诊断方法快速、准确，能很好的代替常规方法，提高了检测的准确率和敏感性，加强了时效性，取得了良好的诊断效果，为疾病的快速诊断、流行病学研究提供了科学依据，为建立多重PCR分型诊断方法奠定了基础。 | 
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